文献解读RNAseq助力遗传疾病诊断

导语

近期《ScienceTranslationalMedicine》杂志上刊登了一篇名为《ImprovinggeneticdiagnosisinMendeliandiseasewithtranscriptomesequencing》的文章，该项研究为第一个利用RNA-seq进行孟德尔遗传疾病的基因诊断的队列研究。研究结果表明RNA-seq能够帮助鉴定许多DNA测序中未能鉴定的剪接变异，首次证明了遗传疾病中组织活检RNA测序在临床诊断中也具有重要的意义。下面由GEMPLE捷易技术部博士为大家详细解读此篇文献。

一眼速递

高通量测序技术已经越来越多的应用于临床疾病的分子诊断中。目前利用WES/WGS等手段进行基因组序列分析，最高能达到近50%的单基因遗传疾病检出率。然而，更多的问题存在于变异的功能以及临床意义的分析和解读中。

本篇文章中，作者通过对一个大的原发肌肉病队列（n=63）中患者的肌肉组织进行RNA-seq，与数据库中正常肌肉的表达谱进行以下比较分析：

1）在13个已经通过基因组分析找到致病变异的患者中进行了变异的功能验证；

2）在剩余的50个未明确致病变异的患者中，进一步鉴定出了17个患者的致病变异（检出率高达35%）；

3）鉴定出了一个常见的新发COL6A1变异，该变异会导致显性激活的内含子保留剪接，使胶原VI异常，导致严重的肌营养不良。

接下来就跟随着小编的脚步，仔细学习一下这篇文献吧~

解读专栏

01

为了验证RNA-seq能应用于人类遗传疾病的诊断，研究人员首先对入组患者的肌肉活检组织进行RNA-seq，然后与GTEx（Genotype-TissueExpressionConsortium）数据库中选取的肌肉数据进行对照，验证DNA-seq检测的阳性样本中相关变异造成的转录异常，并对DNA-seq检测的阴性样本进行异常剪接、等位基因表达不平衡、变异等多种分析。

02

1、样本选择

研究者共选取63例原发性肌肉病变患者，其中13例为已知致病变异且至少有一个功能缺失或剪接变异的患者，这组既作为阳性对照，同时又用于算法验证；另外50例患者在既往基因检测中未确定明确的致病变异（既往基因检测中检出临床意义不明的潜在剪接变异的患者数N=4；从临床表型可以明确相关的单基因，但未检出致病变异或隐性遗传疾病仅检出一个杂合变异的患者数N=12；既往基因检测未检出潜在致病变异的患者数N=34）。

2、数据及样本质控

在比较分析之前，研究者利用GTEx数据库，通过基于转录本表达量的主成分分析（PCAanalysis）帮助去除了两个可能有脂肪组织污染的样本。

3、RNA-seq数据分析

3.1与正常的肌肉组织进行转录组比较分析

基因的表达量是RNA-seq中最常规也最重要的分析方向，那么通过鉴定病患肌肉组织中异常表达的基因能不能帮助研究人员快速锚定致病基因呢？

研究者对基因的表达量进行了均一化处理和比较，发现单个患者样本中异常表达基因的中位数是(所有基因)，37（OMIM基因）和2（神经肌肉病相关基因）（下图A）。然而在12个阳性样本中只有1个致病基因的表达发生了异常变化（下图B）；同时6个dystrophin蛋白表达异常的DMD患者中只有3个通过RNA表达量检测出异常。

这些数据说明：单单进行异常表达基因分析不能有效找到疾病致病基因。

3.2利用新开发的算法来鉴定异常剪接事件

除了表达水平外，RNA-seq还能进行一些其他分析，如剪接分析、等位基因表达分析和变异分析。这些信息是否能够帮助鉴定致病变异呢？

研究者首先对已知的阳性样本进行了测序数据的肉眼分析，他们在6个样本中观察到了8个致病变异对应的异常剪接事件，说明通过RNA-seq来研究影响剪接的变异是可行的。

对于没有DNA测序数据提示可能致病变异的样本来说，建立一个算法来鉴定异常的剪接事件非常的必要。所以研究者们开发了一个新的异常剪接事件鉴定算法，并应用到了本研究的数据中。（算法信息可参考：







































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