浅谈转录组测序之概念介绍与应用

一、有关转录测序的重要定义与介绍

1.转录组（transcriptome）：特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的集合，包括mRNA和ncRNA，从整体水平研究基因功能和基因结构，揭示特定生物学过程的分子机理。

2.转录组测序（RNA-seq）：通过第二代高通量测序技术进行cDNA测序，全面快速地获取某一物种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本。一般转录组测序指对mRNA反转录cDNA进行转录组测序分析。可分析转录本的结构和表达，发现未知转录本，识别可变剪切位点和SNA等。适用于生长发育、环境适应、免疫互作、野生突变表型、分子标记开发等。

3.microRNA

（1）定义：MicroRNA（miRNA）是一类内生的、长度约20-24nt的小RNA，在细胞内具有多种重要的调节作用，参与许多生命过程，如细胞增殖、细胞凋亡、脂肪代谢和细胞分化等。

（2）microRNA特点：

表达具有组织特异性和阶段特异性。具有高度保守性，即能在其他物种中找到同源体。具有独有的序列特征，如5’端第一个碱基对U有强烈倾向性。一个miRNA可调控多个基因表达，几个miRNAs也可共同调控某个基因的表达。

（3）microRNA在体内生成过程

长的内源性多个茎环结构的转录本（pri-miRNA)经Drosha酶作用生成miRNA前体(pre-miRNA)。将pre-miRNA经Dicer酶作用加工为成熟miRNA，该过程发生在细胞质中。miRNA与细胞质中的某些特定蛋白（如AGO）结合形成RISC，对靶mRNA进行调节。

（4）miRNA的作用机制

1）翻译抑制：

miRNA与靶mRNA通过6-7个碱基互补结合，可导致miRNA在蛋白质翻译水平上抑制靶基因表达（哺乳动物中比较普遍）。

2）mRNA的降解：

miRNA也有可能影响mRNA的稳定性。如果miRNA与靶位点完全互补（或者几乎完全互补），那么这些miRNA的结合往往会引起靶mRNA的降解(在植物中比较常见)。

3）转录调控：

表观遗传是指在核酸序列水平上不涉及基因组改变的遗传变化。最近研究发现表明，miRNA影响基因启动子的CpG岛甲基化作用，在转录水平直接对靶基因进行调控作用。

备注：已知miRNA最广泛的功能为：靶向负调控基因的mRNA水平，介导其降解。但其实还有另外7种：miRNA的前体pri-miRNA可翻译为多肽；miRNA可与其他功能蛋白相结合；miRNA可直接激活TLR受体蛋白（非改变表达量）；miRNA可提高蛋白表达水平；miRNA靶向调控线粒体相关基因mRNA；miRNA可直接激活基因转录过程；miRNA可靶向负调控其他非编码RNA的前体RNA。

（5）应用方向：

适用范围广：大部分miRNA来源于基因间区，适用于有参考基因组或转录组信息的物种。

适用研究方向全面：所有适用于转录组研究的生物学性状，如发育调控、环境适应、免疫互作。

产品类型：根据miRNA的不同特征可分为3类：动植物miRNA鉴定分析,病毒siRNA分析,动植物siRNA鉴定分析：piRNA，NatRNA，phasiRNA。（备注：所有piRNA只能应用于动物生殖组织中，植物不能做）

联合分析：可以与任何转录调控产品进行联合分析，如：转录组+小RNA；lncRNA+小RNA；circRNA+小RNA+lncRNA；甲基化+mRNA+小RNA。

4.lncRNA

（1）定义：长链非编码RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）是一类长度大于nt的非编码RNA，其在转录沉默、转录激活、染色体修饰、核内运输等均具有重要的功能。

（2）特点：

lncRNA的长度在-nt之间，具有mRNA相似的结构，经剪接，具有ployA尾巴以及启动子结构，分化过程中有动态的表达以及不同的剪接方式，形成不同的lncRNA；

lncRNA一般无蛋白编码能力，但是有很多lncRNA能编码一些短肽；

lncRNA的保守性较低；

lncRNA的表达具有组织特异性以及时空特性。不同的组织表达lncRNA的量是不同的，即使是同一组织中，处于不同状态时表达量也不同；

lncRNA的定位有区别。不同的lncRNA在细胞内（外）的丰度不同。

（3）分类：

AntisenselncRNA(反义长链非编码RNA)

Intronictranscript(内含子非编码RNA)

LargeintergenicnoncodingRNA(lincRNA，基因区间的lncRNA)

Promoter-associatedlncRNA(启动子相关lncRNA)

UTRassociatedlncRNA(非翻译区lncRNA)

（4）lncRNA作用机制

1）DNA水平：

在基因上游启动子区转录，干扰下游基因的表达；

抑制RNA聚合酶II或介导染色质重构、组蛋白修饰，影响下游基因的表达；

2）RNA水平：

与基因转录本形成互补双链，影响翻译，剪切，mRNA的稳定性(类似miRNA功能)；

与转录本形成互补双链，在Dicer酶的作用下产生内源性siRNA；

作为小分子RNA（如miRNA、piRNA）的前体分子；

lncRNA起到miRNA海绵作用，调控靶基因表达；

3）蛋白水平：

与特定蛋白质结合，调节相应蛋白的活性；

作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体；

结合到特定蛋白质上，改变蛋白质的细胞定位

备注：适用物种：有参考基因组的真核生物

（5）lncRNA应用方向

5.circRNA

（1）circularRNA定义和分类

环状RNA（circRNA）是一类特殊的非编码RNA分子，呈封闭环状结构，对核酸酶不敏感，比线性RNA更稳定，不易降解，这使得环状RNA在作为新型临床诊断标记物的开发应用上具有明显优势。

circRNA主要是由外显子环化而成，而有部分circRNA是由内含子环化而成的套索结构（lariat）

circRNA主要来自编码基因的外显子，也可能来自编码基因的内含子、基因间区、UTR区域或非编码RNA基因位点

（2）CircRNA的特点：

circRNA无PolyA的尾巴

常规线性的RNA有一些多聚A的尾巴，而circRNA是闭合的环状RNA，其大部分均是由外显子构成的，所以并无多聚A的尾巴。

circRNA的细胞定位、丰度

绝大多数circRNA在细胞浆中富集，其丰度有时甚至比相应的线性mRNA高10余倍。

circRNA的稳定性：

闭合的环状结构使其不易被核酸酶降解。

circRNA具有细胞与组织特异性，不同物种间进化保守性很强。

极少数circRNA翻译为蛋白。

circRNA作为内源性竞争RNA(ceRNA)

多数具有miRNA应答元件，能与miRNA相互作用，从而调控靶基因的表达。

（3）circRNA作用机制

这张图说的是circRNA的已知功能，可以有多种研究方向，这些都可以作为很好的科研故事，有的在胞核内，有的来自于胞质中的机制，有的作为分泌物标记marker。

1）细胞核：

假设转录本的表达量是一定的，circRNA的形成本身影响了其他同源转录本的结果；

circRNA会滞留在细胞核内，结合核小核糖核酸蛋白，调控某些基因的转录；

circRNA滞留在核内一定数量后，直接阻断母本DNA的其他转录本的转录，也可以称之为“负反馈回路调控”。

2）细胞质：

circRNA机制作为海绵吸附miRNA，正向调控下游靶基因的表达水平；

circRNA在胞质内吸附蛋白质形成circRNPs行使功能；

胞质中的circRNA参与翻译成多肽；

circRNA行使假基因的功能，具有调控基因表达的潜能。

3）细胞外：

分泌到血液、唾液等体液中作为疾病预测的biomarker，另外它在某些细胞分泌的外泌体中大量存在，起到了细胞与细胞之间的频繁对话，也是一个研究非常火热的领域。

（4）circRNA测序策略

二、全转录研究

全转录组概念全转录组是指细胞所能转录出来的所有类型RNA的总和，包括mRNA和非编码RNA（non-codingRNA，ncRNA）。目前针对非编码RNA的研究主要集中在smallRNA，lncRNA和circRNA。对特定细胞的特定状态下全转录组的研究，可以从RNA层面系统地揭示生物学背后的转录调控规律。非编码RNA（smallRNA，lncRNA和circRNA）和mRNA相互作用系统地参与转录调控。

2.ceRNA介绍：年，Pandolfi等人提出了一种关于mRNAs、Pseudogenes，lncRNAs如何相互“交流”的新假说----ceRNA（